聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)涉及的步驟

  1. 樣品制備

 

  • 樣品可以是任何包含蛋白質或核酸的材料。
  • 如果需要,可以將分析樣品與化學變性劑混合,通常將SDS用于蛋白質,將尿素用于核酸。
  • SDS是一種陰離子去污劑,可使二級和非二硫鍵連接的三級結構變性,并根據其質量成比例地對每種蛋白質施加負電荷。尿素打斷核酸堿基對之間的氫鍵,使組成鏈退火。將樣品加熱到至少60°C會進一步促進變性。
  • 可以將跟蹤染料添加到溶液中。它通常具有比分析物更高的電泳遷移率,以允許實驗人員在電泳過程中跟蹤溶液通過凝膠的過程。
  1. 聚丙烯酰胺凝膠的制備
  • 凝膠通常由丙烯酰胺,雙丙烯酰胺,可選的變性劑(SDS或尿素)和pH值已調整的緩沖液組成。
  • 出于特殊目的,可以改變雙丙烯酰胺與丙烯酰胺的比例,但通常為35的約1份。凝膠的丙烯酰胺濃度也可以改變,通常在5%至25%的范圍內。
  • 較低百分比的凝膠更適合解析分子量非常高的分子,而解析較小的蛋白質則需要更高百分比的丙烯酰胺,
  • 凝膠通常在凝膠澆鑄機中的兩個玻璃板之間聚合,并在頂部插入梳子以形成樣品孔。
  • 凝膠聚合后,可以將梳子移開,并準備進行電泳。
  1. 電泳法
  • PAGE中使用各種緩沖液系統,具體取決于樣品的性質和實驗目的。
  • 用于陽極和陰極的緩沖劑可以相同或不同。
  • 在凝膠上施加電場,使帶負電荷的蛋白質或核酸從負離子向正電極(陽極)穿過凝膠遷移。
  • 根據它們的大小,每個生物分子在凝膠基質中的移動方式不同:小分子更容易穿過凝膠中的孔,而大分子則更困難。
  • 凝膠通常運行幾個小時,盡管這取決于施加在凝膠上的電壓。
  • 在設定的時間后,生物分子將根據其大小遷移不同的距離。
  • 較小的生物分子沿凝膠向下移動的距離較大,而較大的生物分子則保持更靠近起點。
  • 因此,可以根據大小大致分離生物分子,其大小主要取決于變性條件下的分子量,但也取決于天然條件下的高階構象。
  1. 偵測
  • 電泳后,可對凝膠進行染色(對于蛋白質,最常見的是考馬斯亮藍或放射自顯影;對于核酸,溴化乙錠;對于銀染,則可以),以使分離的蛋白質可視化,或者進行進一步處理(例如Western blot) )。
  • 染色后,不同種類的生物分子在凝膠中顯示為不同的條帶。
  • 通常通過在凝膠中的另一條泳道中運行已知分子量的分子量大小標記物來校準凝膠并通過比較相對于標記物的移動距離來確定未知生物分子的近似分子量。
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